主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法(实验)

发布时间:2019-06-24

主要食用菌(如杏鲍菇、红菇、姬松茸、香菇、草菇、牛肝菌、鸡腿菇、金针菇、双孢蘑菇、猪肚菇、凤尾菇、小平菇、秀珍菇、猴头菇、金顶侧耳、茶树菇、竹荪、黑木耳、白木耳等)中转基因成分的检测。

 

一、实验原理:

 

样品经过提取 DNA 后,针对转基因食用菌所导入的常见外源基因的基因序列设计引物,通过 PCR技术,对外源基因的 DNA 片段进行特异性扩增,根据实验结果,判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。

 

二、仪器配置:


1、电子天平:感量为0.001g与0.0001g。

2、粉碎机。

3、鼓风干燥箱。
4、微量移液器:体积范围是0.20μL~2.0μL, 2μL~20μL, 20μL~200μL, 200μL~1000μL,枪头用前应高压灭菌处理。
5、旋涡振荡器。

6、恒温水浴锅:恒温范围为室温~100℃ ,精度为±0.5℃ 。

7、台式高速离心机,低温冷冻高速离心机,小型瞬时离心机。

8、 DNA 浓缩仪。
9、核酸蛋白分析仪。

10、PCR 仪。

11、电泳仪。

12、电泳槽。

13、凝胶分析成像系统。

14、PCR超净工作台或生物安全柜。

15、微波炉。
16、高压灭菌锅。
17、PH 计。
18、制冰机。
19、纯水机。

20、低温冰箱(-20℃以下)。

21、真菌NDA提取试剂盒。

 

三、测定方法:

 

1、DNA提取

 

      称取100 mg烘干后研磨成粉的样品,于1.5 mL的离心管中,加 600 μL 2%CTAB缓冲液,5 μL蛋白酶K( 20 mg/mL) ,5 μL Rnase A(10 μg/mL ) ,剧烈振荡30 s以上, 65℃温浴1h,期间定期振荡。 加600 μL水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25:24:1) ,剧烈振荡, 12000 g离心15 min。 取上清液,再加等体积的水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25:24:1) ,振荡混匀,12000 g 离心 15 min。 取上清液,加0.8倍体积异丙醇,混匀,12000 g 离心10 min。 取沉淀,加入400 μL氯化钠(1 mol / L)于65℃温浴中溶解,加等体积的水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25:24:1) ,振荡, 12000 g离心15 min。 取上清液,加2倍体积的无水乙醇,轻微振荡, 12000 g离心10 min。取沉淀, 70%乙醇清洗2次,干燥,加100 μL TE(pH8.0)溶解。每个样品设2个重复。


2、DNA 浓度与纯度测定

 

      DNA 用核酸蛋白分析仪测定260nm和280nm 处吸收值,分别计算DNA纯度与浓度,DNA 纯度等于 OD260/OD 280 ,比值在1.7~2.0之间较为理想。 双链 DNA 浓度(μg/mL)等于50倍 OD260值。

 

3、定性PCR检测

 

(1)PCR反应体系

         食用菌中的内源 18 Sr DNA 基因与外源基因采用的PCR 检测体系见表1。 每个样品反应体系设2个重复(同时做2管)。

表1 定性PCR检测参考反应体系

(2)PCR 反应体系对照的设置

         PCR检测时设立置阳性对照、阴性对照和空白对照。

         阳性对照:转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的 DNA。
         阴性对照:非转基因食用菌中提取的DNA。
         空白对照:用配制反应体系的实验用水代替模板。


(3)PCR反应热循环参数的设置

         94℃预变性2min。 94℃变性30s ,54℃退火40s ,72℃ 延伸1 min ,40个循环。 72℃ 延伸 5min 。 4℃下保存。 也可根据不同的基因扩增仪对PCR反应热循环参数做相应的调整。


(4)PCR扩增产物的电泳检测

        用0.5×TBE 电泳缓冲液制备2 % 的琼脂糖凝胶。 将 8 μL~10 μL 的 PCR扩增产物 分别与1 μL~2 μL的6×加样缓冲液(电泳前沿指示剂)混合后,在凝胶板上的孔中点样。 用分子量大小适当的 DNA Marker 做分子量标记。 选择合适的电压( 3V/cm ~5 V / cm),电泳时间为 5o min~60min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。


5、结果判断


(1) 样品DNA抽提质量判断

          按照真核生物共有的核糖体18 Sr DNA基因的序列设计的引物,对食用菌阴性样品与待测样品的DNA 提取液进行PCR 扩增。 均应扩增出137 bp的片段,否则,说明提取的 DNA 质量有问题,或者是DNA 溶液中存在 PCR 反应的抑制因子,应该重新纯化或提取DNA,直至扩增出该DNA片段,防止检测中产生假阴性结果。


(2) 外源基因的检测
          阴性对照与空白对照未扩增出DNA 片段,阳性对照扩出预期的 DNA 片段,待测样品未扩增出预期的 DNA 片段,可以断定待测样品中不含有外源基因,如果扩出预期的 DNA 片段,则可初步判定待测样品中含有可疑的外源基因,应进一步进行确证实验。


(3)结果确证实验与结果表述

         1)采用实时荧光PCR检测方法或者委托有资质的生物技术公司进行委托确证。
         2)结果表述:确证为阳性的,表述为:检出 × × × × 基因;确证为阴性的,表述为:未检出××××基因。


 5、样品保存


(1) 保存条件
          燥样品保存在常温下,新鲜样品保存于-20℃下。


(2)保存期限:3个月。